ХЕМІЛЮМІНЕСЦЕНТНИЙ АНАЛІЗ

ХЕМІЛЮМІНЕСЦЕНТНИЙ АНАЛІЗ — різновид кінетичного методу (див. Кінетичні методи аналізу) визначення іонів і хімічних сполук за інтенсивністю хемілюмінесценції або сумою світіння (інтеграл залежності інтенсивності хемілюмінесценції за часом). Будь-який емпірично встановлений вплив того чи іншого реагенту (напр. іонів перехідних металів та деяких аніонів, які виступають у ролі каталізаторів, а також органічних сполук — активаторів та інгібіторів хемілюмінесцентних реакцій (див. Хімічні активатори та інгібітори хемілюмінесценції)) на параметри хемілюмінесценції, пропорційні швидкості індикаторної реакції та квантовий вихід люмінесценції може бути основою кількісного методу аналізу на дану речовину, навіть якщо невідомий механізм виникнення хемілюмінесценції. У Х.а. зазвичай використовуються реакції окиснення хемілюмінесцентних індикаторів (див. Хемілюмінесцентні індикатори), у яких індикаторною речовиною є проміжні сполуки — випромінювачі світіння; окисники — гідроген пероксид, пероксикислоти, оксиген тощо. На відміну від флуоресцентних методів при проведенні визначення не вимагається додаткового джерела збудження, через що суттєво спрощується постановка експерименту й усувається фонове розсіювання світла. Дозування проб або реагентів може відбуватися дискретно (в аналізаторах дискретних проб) або у неперервному режимі (проточні аналізатори), вимірюється або значення піку світлової інтенсивності, або інтегральна характеристика — сума світіння. Реєстрація параметрів хемілюмінесценції може здійснюватися фотоелектрично (на хемілюмінометрі за допомогою фотоелектронного помножувача або кремнієвого фотодіоду із самописцем та електронним інтегратором) та фотографічно (вимірюється лише сума світіння за певний проміжок часу). Перевагами методів Х.а. є висока чутливість, можливість реєстрації інтенсивності світіння у широкому діапазоні значень, що відповідає великому інтервалу концентрації визначуваних речовин (зазвичай декілька порядків). Цей метод аналізу можна здійснювати дуже швидко, оскільки немає необхідності чекати, поки реагуючі речовини досягнуть стану рівноваги.

Х.а. переважно використовували для визначення дуже низьких концентрацій катіонів перехідних металів за їх каталітичним впливом на хемілюмінесцентні реакції. Деякі вчені вважають, що ці реакції відносять до каталітичних помилково: катіони піддаються незворотним перетворенням, які призводять до виникнення неактивних сполук цих елементів у високих ступенях окиснення, а отже, каталітичний цикл (якщо він взагалі має місце) неможливий.

Кількісний Х.а. був започаткований українським ученим професором А.А. Пономаренком (1953), а потім інтенсивно розвинений київською школою академіка УРСР А.К. Бабка та Львівськими дослідниками, особливо в 70–90-х роках ХХ століття.

Так, за реакцією з люмінолом (див. Хемілюмінесцентні індикатори) можна визначати нанограмові (нг/мл) кількості катіонів таких металів, як Сu (II), Co (II), Ni (II), Fe (III), Mn (II), Cr (III) та інші, за наявності відносно простих приладів — хемілюмінометрів. Найнижча межа виявлення досягнена при визначенні Co (II) (<10–11 М). Це пояснюють утворенням комплексу іону металу з Н2О2, відповідального в подальшому за окиснення хемілюмінесцентного індикатора з утворенням емітера у лімітуючій стадії процесу виникнення світіння. У присутності надлишку люмінолу можна визначати Cr (III) в інтервалі 0,01–20 мкг/мл, а також Fe (III) і Co (II) як в індивідуальних розчинах, так і в сумішах (Fe (III) маскують комплексоном), Fe (III) (≥ 2·10–8 М) у присутності співмірних кількостей Fe (II) (як окисник використовують дипероксидикарбонову кислоту) в присутності великого надлишку 1,10-фенантроліну (активатора Fe (III) та водночас маскуючого ліганду Fe (II)), Pt (IV) в присутності Pt (II) і Pd (II), а також інші катіони з межами виявлення, які знаходяться в інтервалі від 10–10 до 10–8 М. Можна визначати і гідроген пероксид, використовуючи як каталізатор Сu (ІІ), або нанограмові кількості (нг/мл) аліфатичні моно- та дипероксикарбонові кислоти як такі або в присутності надлишку гідроген пероксиду (1·10–4–1·10–3 М) за хемілюмінесцентною реакцією з люмінолом.

Хемілюмінесцентна система люмінол/атмосферний оксиген використана для визначення купруму (II) (0,2–600 нг/мл) у присутності ціаніду як активатора, а також при визначенні Sn (II) (Сmin 1 нг/мл). Заважаючий вплив чинять катіони Ir (IV), V (V) та Au (III). При використанні як окисника перйодату можливе визначення Ir (IV) у присутності Rh (III).

Цей індикатор можна використовувати і для визначення аніонів: так, мікро- або субмікромолярні кількості діоксиду хлору або гіпохлориту у водних розчинах можна визначати у неперервному режимі. Цей варіант аналізу був використаний для визначення нанограмових кількостей (нг/мл) фосфору, арсенуму та силіціуму за реакцією відповідних гетерополікислот з люмінолом. Для визначення PO43-, AsO43-, GeO32-, SiO32- опрацьовані високочутливі хемілюмінесцентні методики з попереднім сорбційним концентруванням гетерополікислот або їх іонних асоціатів з катіонними поверхневоактивними речовинами на паперових фільтрах. Сmin 1 нг/мл. Розроблені методики, які поєднують реакційну динамічну газову екстракцію з хемілюмінесцентним детектуванням за реакцією з люмінолом на межі фаз газ — рідина. Високі значення коефіцієнтів дифузії в газах порівняно зі значеннями таких у рідинах обумовлюють швидке виникнення «відгуку» у вигляді хемілюмінесценції під час перебігу реакції. Цей варіант хемілюмінесцентного аналізу використаний для мікровизначення аніонів у водах: Br-, I-, NO2-, NO3-, Cl-, ClO-, BrO3-, ClO3-, IO3-. Визначуваний аніон перетворюють на хемілюмінесцентно активний продукт (I2, Br2, Cl2, NO2), який потім вилучають із водного розчину інертним газом і визначають за люміноловою реакцією з Сmin ≅1 нг/ мл. Час виконання аналізу — 5 хв.

Х.а. знаходить усе більше застосування в різноманітних галузях народного господарства та медицині, напр. в аналізі клінічних проб за допомогою ферментних реакцій.

За допомогою методів Х.а. визначають не лише активність окремих ферментів, але й концентрацію різних речовин, які беруть участь у ферментних хемілюмінесцентних реакціях. Реакції, які використовують для вивчення активних форм оксигену, можуть бути модифіковані для визначення активності ферментів антиоксидантної системи організму. При вимірюванні активності відомих ферментів надоксиддисмутази (СОД) і каталази використовують ксантин-ксантиноксидазну і ацетальдегід-ксантиоксидазну системи, які є генераторами ·ОО- і Н2О2 відповідно. Інтенсивність розкладання цих продуктів реакції в присутності антиоксидантних ферментів вивчають за інтенсивністю хемілюмінесценції люмінолової або люцигенінової реакцій. Для визначення активності каталази часто застосовують систему люмінол — люцигенін — Н2О2.

У біохемілюмінесцентній люциферин-люциферазній реакції джерелом енергії для світіння є АТР. Тому цю реакцію використовують для визначення концентрації аденозинтрифосфату або будь-якого іншого метаболіту і ферменту, які беруть участь у реакціях утворення або розкладання АТР. Вимірювання його вмісту в культурах пухлинних клітин за допомогою Х.а. у біохемілюмінесцентній реакції дозволяє значно спростити експеримент. Для визначення вмісту АТР розроблені стандартні набори реагентів — фірми «Sigma» (США), «LKB» (Швеція) та інші, які знайшли широке застосування в медицині, а також синтетично добута серія рекомбінантних світлячків люцифераз, які дозволяють концентрацію нуклеозидтрифосфату в інтервалі концентрацій 0,01–10 000 нМ. Використовуючи бактеріальні люциферази, для функціонування яких необхідні NADP(H), а також хемілюмінесцентний метод, можна визначити активність ферменту дегідрогенази. Застосовуючи хемілюмінесцентну систему люмінол — Н2О2 — пероксидаза (каталізатор), можна здійснювати контроль за перебігом ферментних реакцій за участю оксидаз, в яких утворюється гідроген пероксид. На основі цього принципу опрацьовані методики дослідження метаболізму глюкози, холестеролу і фосфоліпідів. Ксантогеназа, β-D-галактоксидаза і глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа можуть детектуватися за люміноловою індикаторною реакцією, хемілюмінесценція якої пов’язана з утворенням ·ОО- і Н2О2.

Для вимірювання активності інгібіторів ферменту ацетилхолінестерази (АХЕ) застосовують систему люмінол — пероксидаза — (Н2О2) та проміжну реакцію, в якій холін — продукт первинної реакції холінестеразного гідролізу ацетилхоліну — окиснюється в присутності іншого ферменту холіноксидази до бетаїну з утворенням гідроген пероксиду. Інтенсивність хемілюмінесценції прямо пропорційна активності АХЕ і обернено пропорційна вмісту інгібітора в системі.

Для ферментного визначення інгібіторів АХЕ за допомогою хемілюмінесцентного аналізу запропонований оригінальний спосіб, який вдало поєднує високу вибірковість реакції холінестеразного гідролізу субстрату ацетилхоліну з високою чутливістю індикаторної реакції хемілюмінесцентного окиснення люмінолу: активність АХЕ у ферментній реакції оцінюють за залишковою кількістю субстрату, який за допомогою реакції пергідролізу (реакція з надлишком Н2О2) перетворюють на відповідну надацетатну кислоту, а потім останню визначають за люміноловою реакцією в присутності Н2О2 як активатора процесу. Усі реакції відбуваються за оптимальних умов при рН 8,2. Цей метод здійснення Х.а. дозволяє визначати різноманітні за структурою біологічно активні (інсектициди, пестициди, сильнодіючі та отруйні речовини) та лікарські речовини на наногамовому (нг/мл) рівні.

Визначення ферменту ліпази ґрунтується на ферментному гідролізі діацетату флуоресцеїну до флуоресцеїну, а отже, впливі на емісію світіння в системі люмінол —Н2О2 — пероксидаза (див. Фізичні активатори, сенсибілізатори).

Хемілюмінесцентне детектування (за допомогою різних хемілюмінесцентних індикаторів) компонентів суміші в потоці після їх хроматографічного розділення застосовується для аналізу різноманітних біологічно активних та лікарських речовин. Для післяколонкового детектування у високоефективній рідинній хроматографії найчастіше використовують пероксіоксалатні хемілюмінесцентні реакції.

Х.а. використовується також в капілярному електрофорезі, що дозволяє ідентифікувати і кількісно визначати різні компоненти (напр. амінокислоти) у складних сумішах. При цьому досягнено високої чутливості (≅10–17 М) і вибірковості.

Антиокисну здатність речовин можна вимірювати за допомогою Х.а. при застосуванні системи люмінол — Н2О2 — пероксидаза (або гемоглобін), в якій антиокисники конкурують з люмінолом за участь у реакціях з радикалами оксигену, що призводить до зміни параметрів хемілюмінесценції в системі. За допомогою Х.а. можливе визначення ендогенного антиоксидантного рівня біологічних зразків. Промисловість продукує низку стандартних наборів (зокрема ARAP, ARAP-PLUS) для визначення антирадикальної активності водорозчинних речовин, аскорбінової кислоти, загального антиоксидантного статусу системи тощо.

Як один із прикладів комерційного використання Х.а. можна назвати тест-систему на приховану кров ГЕМОТЕСТ-М (син. Делатест) — діагностичний засіб високочутливого та експресного хемілюмінесцентного виявлення залишків крові за гемоглобіном (див. ГЕМОТЕСТ-М), а також тест Гемокод, в основу якого покладена хемілюмінесценція фагів. Пробу венозної крові інкубують з харчовими екстрактами, а потім за інтенсивністю світіння нейрофілів визначають перенесення тих чи інших продуктів. Обидві тест-системи зареєстровані в Україні.

Завдяки експресності, чутливості, можливості автоматизації вимірювання й комп’ютерної обробки одержаних результатів Х.а. знаходить усе ширше застосування для вирішення практичних завдань в аналітичній хімії, фармацевтичному аналізі, а також біології та медицині.

Бабко А.К., Дубовенко Л.І., Луковская Н.М. Хемилюминесцентный анализ. — К., 1966; Индикаторы / Под ред. Э. Бишопа. — Т. 2. — М., 1976; Chemiluminescence in analytical chemistry / Ed. By Ana M. Garcia-Campaňa. — New York; Basel, 2001.